圖1 活體成像應(yīng)用方向

可見(jiàn)光成像技術(shù)主要分為熒光和生物自發(fā)光兩種，兩種成像方法的原理如下圖。

圖2 熒光成像與生物自發(fā)光成像原理^[1]

熒光成像利用一定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光激發(fā)熒光物質(zhì)，可以發(fā)射出比激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光。生物自發(fā)光成像則是利用熒光素在熒光素酶的催化下消耗ATP，并與氧氣反應(yīng)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的熒光射線。

從上圖可以看出，在使用熒光成像時(shí)，生物組織也會(huì)在外部光源的激發(fā)下發(fā)出自發(fā)熒光以及光散射，對(duì)成像造成干擾。自發(fā)熒光主要集中在可見(jiàn)光波段，可以通過(guò)對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行修飾，將熒光發(fā)射波段延伸到近紅外區(qū)域，減少自發(fā)熒光的產(chǎn)生，提高成像質(zhì)量和成像深度。自發(fā)光成像不需要外部光源，并且沒(méi)有熒光素的生物組織部分不會(huì)發(fā)光，所以沒(méi)有背景光影響。在亮度低的情況下，信噪比反而更高，適合觀察微弱的生物信號(hào)^[2]。

2004年, Tamara Troy 等人對(duì)熒光成像和自發(fā)光成像的強(qiáng)度進(jìn)行了研究，通過(guò)給同一只小鼠左側(cè)注射HeLa-luc/PKH26 細(xì)胞，右側(cè)注射HeLa-luc細(xì)胞，分別實(shí)現(xiàn)熒光成像和自發(fā)光成像。結(jié)果表明熒光信號(hào)比自發(fā)光信號(hào)高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，但是較高的背景自發(fā)熒光大大地降低了信噪比。基于他們所使用的探測(cè)器，生物發(fā)光只需要900個(gè)細(xì)胞就能被檢測(cè)出來(lái)，而熒光至少需要1.5x105個(gè)細(xì)胞積累的信號(hào)才能大于背景熒光。

圖3 熒光與自發(fā)光發(fā)射光信號(hào)的強(qiáng)度與信噪比^[2]

良好的成像質(zhì)量是獲取細(xì)胞、生物體特征狀態(tài)或特征分子分布等信息的關(guān)鍵，那么在探測(cè)器的選擇上就需要考慮到如何在弱信號(hào)，長(zhǎng)時(shí)間曝光等情況下獲得高質(zhì)量的圖像：

• 靈 敏 度：正如前面提到的可見(jiàn)光成像產(chǎn)生的光信號(hào)非常微弱，尤其是生物自發(fā)光應(yīng)用，如果探測(cè)器的靈敏度不足，則采集不到足夠辨識(shí)的光信號(hào)，難以獲得高信噪比的成像結(jié)果，導(dǎo)致檢出限高。
  

• 量子效率：CCD相機(jī)的量子效率（Quantum Efficiency, QE）與靈敏度息息相關(guān)。量子效率指?jìng)鞲衅髂軌驅(qū)⑷肷涔庾愚D(zhuǎn)化為電子的效率，量子效率越高，相機(jī)能夠探測(cè)到的光子就越多。工業(yè)級(jí)的CCD相機(jī)通常只具有50%的量子效率，而科研級(jí)的CCD相機(jī)可以實(shí)現(xiàn)90%以上。

• 噪 聲：同樣由于信號(hào)較弱，因此探測(cè)器背景噪音的大小至關(guān)重要，特別是在長(zhǎng)時(shí)間曝光的情況下，傳感器內(nèi)部由于隨機(jī)熱運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的噪聲，即暗電流(e-/pixel/s)，將會(huì)逐漸積累，甚至?xí)蜎](méi)有用信號(hào)。而低溫可以抑制傳感器內(nèi)部的熱運(yùn)動(dòng)，降低暗電流，其隨溫度的變化可以由下圖參考。暗電流偏大也是不在這類應(yīng)用下使用CMOS相機(jī)的原因。

圖4 暗電流與溫度的關(guān)系

• 動(dòng) 態(tài) 范 圍：需要寬動(dòng)態(tài)范圍來(lái)捕獲同一圖像內(nèi)的弱信號(hào)與強(qiáng)信號(hào)，避免出現(xiàn)在長(zhǎng)時(shí)間曝光后，弱信號(hào)還沒(méi)有檢測(cè)到，強(qiáng)信號(hào)就已經(jīng)飽和。

因此，具有高靈敏度、低噪聲、高動(dòng)態(tài)范圍的科研級(jí)CCD探測(cè)器是實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量活體成像系統(tǒng)的關(guān)鍵核心部件。

2020年南錫自動(dòng)化研究中心（CRAN）研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了基于生物自發(fā)光成像和X射線成像聯(lián)合的活體成像系統(tǒng)optiMAX（如圖5）^[3]。該系統(tǒng)主要由X射線源、反射鏡、熒光屏和CCD四部分組成，實(shí)現(xiàn)了最小0.2 mm的圖像空間分辨率。如圖6展示了不同熒光素濃度條件下的U87-Luc2惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物自發(fā)光成像結(jié)果，可以看到，即便使用的熒光素濃度只有20 μg/mL，曝光時(shí)間只有90s，U87-Luc2細(xì)胞也可以清晰地被觀測(cè)到。這主要得益于具有高靈敏度和深度制冷的科研級(jí)CCD探測(cè)器。

圖5 基于生物自發(fā)光成像和X射線成像聯(lián)合的活體成像系統(tǒng)optiMAX

圖6 U87-Luc2細(xì)胞在不同熒光素濃度和細(xì)胞數(shù)量條件下的生物自發(fā)光成像結(jié)果

• 可以實(shí)現(xiàn)-100℃的深度制冷，暗電流噪聲低至0.0005 e-/pixel/s，即使在長(zhǎng)時(shí)間曝光下也可以確保實(shí)現(xiàn)極佳的信噪比。

• 可以選擇多種傳感器類型以及抗反射涂層，在大多數(shù)熒光素酶的發(fā)射波長(zhǎng)以及近紅外波段范圍內(nèi)具有超過(guò)95%的QE，如圖7，可以檢測(cè)到非常微弱的光子信號(hào)。

圖7 ELSE相機(jī)近紅外增強(qiáng)的QE

• 滿井容量高達(dá)120,000 e-，可以在長(zhǎng)時(shí)間曝光采集弱信號(hào)的情況下，確保強(qiáng)信號(hào)不飽和，實(shí)現(xiàn)高動(dòng)態(tài)范圍成像。

• 具有18bit的AD轉(zhuǎn)化器位數(shù)，可以充分利用CCD傳感器的整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍，以實(shí)現(xiàn)最高的檢測(cè)性能和信噪比。

• 可以進(jìn)行靈活的像素合并操作，具備多種觸發(fā)和同步模式，具備裁剪與連拍模式，可通過(guò)軟件選擇增益，進(jìn)行溫度監(jiān)控。

下圖為使用greateyes ELSE 1024 1024 DD NIR相機(jī)對(duì)小鼠淋巴結(jié)中的癌細(xì)胞進(jìn)行成像檢測(cè)。

圖8 小鼠活體成像

將具有癌細(xì)胞特異性的熒光染料注入小鼠體內(nèi)，通過(guò)外部光源激發(fā)產(chǎn)生熒光。左側(cè)為老鼠的光散射圖像，右側(cè)則展示了光散射與對(duì)淋巴結(jié)腫瘤組織中積累的熒光標(biāo)記染料進(jìn)行熒光檢測(cè)的疊加圖像，大鼠頭部周圍的熒光信號(hào)是由于毛皮的自發(fā)熒光所引起的。

活體成像在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義，能夠實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)地觀察體內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程。熒光與自發(fā)光成像信號(hào)微弱，要求探測(cè)器具備高靈敏度、低噪聲和高動(dòng)態(tài)范圍。greateyes的ELSE系列相機(jī)憑借超低暗電流、超過(guò)90%量子效率和寬動(dòng)態(tài)范圍，能夠滿足這兩類成像的需求，是理想的成像工具。

 greateyes成立于2008年，以德國(guó)柏林洪堡大學(xué)的技術(shù)為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)并銷售高性能科學(xué)相機(jī)，被廣泛應(yīng)用于成像與譜學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。

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[1] Kim S J, Lee H Y. In vivo molecular imaging in preclinical research[J]. Laboratory Animal Research, 2022, 38(1): 31.

[2] Troy T, Jekic-McMullen D, Sambucetti L, et al. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models[J]. Molecular imaging, 2004, 3(1): 15353500200403196.

[3] Jo?l D., Justine J., Alicia C., Hervé S., Sophie P., Imaging Performance of a Multimodal Module to Enhance Preclinical Irradiator Capabilities. Clin. Oncol. Res., 2020, 3(2).

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